Procedimento para a electroforese em gel

A electroforese em gel é uma técnica essencial na biologia molecular para a análise de segmentos de ADN não exceder 25 quilobases ou abaixo de 500 bases. É utilizado por biólogos moleculares treinados para determinar o tamanho de um fragmento de ADN para expericias adicionais como a clonagem de genes. Devido à natureza altamente técnica e biológica, presume-se que os usuários deste procedimento foram treinados em biologia e segurança avançados protocolos em laboratório.

Prepara-se o gel de agarose e outros materiais necessários

O tamanho do segmento de ADN a ser separada é geralmente conhecido de antemão. Isto vai determinar a quantidade deve ser adicionado de agarose (calculada em percentagem) para um tampão de electroforese, conhecido como o tampão TBE ou TAE execução. Por exemplo, um fragmento de ADN de 25 quilobases podem ser separados usando um gel de agarose a 0,5% preparada por dissolução de 50 gramas de pó de agarose em 100 mililitros de TAE em um frasco ou garrafa resistente ao calor. Esta é aquecida suavemente num forno de microondas até que o pó se dissolva. não deve ferver.

gel de monta

A solução de gel de agarose foi misturado com 0,5 microgramas por mililitro de brometo de etídio, um composto que se intercala no ADN e permite que os fragmentos observados no gel. A solução é vertida para um molde de gel pode ter extremidades abertas, as quais devem ser seladas com fita adesiva ou clips de ajustamento para evitar que a solução de vazamento. Um pente de gel é um instrumento usado para inserir poços para amostras em pistas do gel. Um ou mais destes pode ser colocado sobre o gel para criar estes poços de amostra. Deixa-se arrefecer a solução até que a mesma solidifica, o que pode variar de alguns minutos a várias horas, com uma percentagem elevada de géis (aqueles menos diluído) que arrefecer mais rapidamente. Um truque comum é pôr o gel no frigorífico e depois deixar atingir a temperatura ambiente antes do uso. Uma vez preparado, o gel é utilizado o mais cedo possível ou envolvido em película de plástico para evitar a secagem.

Carregar o gel

Uma vez pronto, o gel é preparado por remoção da fita ou clipes das extremidades abertas é essencial para permitir que o fluxo de corrente eléctrica. O gel é suavemente removido e todo o tabuleiro é imerso na Cuba electroforética, contendo tampão de electroforese suficiente para cobrir toda a superfície do gel, evitar a secagem de gel para fora e interfere calções. As amostras de ADN são diluídas com uma carga colorido solução tampão também ancorar o ADN para o bem. Estes são preparados de uma tão pequena quanto possível para satisfazer os poços de volume permitidos criados no volume do gel. Em seguida, as amostras são cuidadosamente carregado em cada poço, para assegurar que não há contaminação cruzada das amostras. um marcador apropriado também incluído em um dos poços para guiar o utilizador no tamanho dos fragmentos de ADN.

Executando o gel

O aparelho de electroforese é preparado a verificação de que os cabos estão orientadas na direcção certa de Cuba, de modo que as amostras de executar o negativo (cátodo) ao gel positivo (ânodo). Tensão também é definida como o nível que é habitualmente utilizado para esse aparelho, por exemplo, 10 volts por centímetro de gel. Uma vez que a tampa é colocada em Cuba, o aparelho é ligado e deixou-se prosseguir a electroforese de um certo tempo. Este deve ser o suficiente para permitir a separação dos fragmentos, mas não demasiado impedir a queda do outro lado do gel e electroforética perdido em Cuba. Após a corrida, o gel foi visto num transiluminador de luz ultravioleta (UV) e as bandas foram observados como linhas fluorescentes brilhantes como intercala brometo de etídio no DNA e fluoresce sob luz UV.